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李曼大会浅析

更新日期:2019年(nian)11月28日 大字 小字
sis Enhancer 溶液至样品中,65 ℃孵育10 min。

3.剧烈涡旋震荡10min。

(此步骤可(ke)选用(yong)研磨(mo)仪,频率:6.5 m/sec ,处理时(shi)间(jian):30S,10个循环(huan))



4.14000 rpm离(li)心(xin)5 min,转移上清400 μl到新(xin)的1.5 ml的离(li)心(xin)管(guan)中。

(注意(yi):离心后上清表面可能出(chu)现一层杂(za)质(zhi),避免吸取这些杂(za)质(zhi),因为这些杂(za)质(zhi)会影响下(xia)游的扩增

5.加(jia)入250 μl S3-Cleanup Buffer,立即彻底混匀。

6.14000 rpm离心2 min,转移全部上清液(约500 μl)到 预分装板的孔1、7中。

打开(kai)核酸自动提取仪,选择编辑程序并命名(ming)“environmental samples”,按(an)照下表进行编辑。

7. 插入(ru)磁棒套,运行编(bian)辑(ji)好(hao)的程序,25min左右(you)程序结束,转移洗脱孔(kong)6、12中的DNA至(zhi)新的离心管(guan)-20℃保存或直接进入(ru)q-PCR 检测。


q-PCR检测 


1、非洲猪瘟扩增反应液的配制

取出PCR反(fan)应(ying)液,室温(wen)融化后,取相应(ying)份数(shu)(反(fan)应(ying)液20μl/T、Taq 酶0.2μl/T)混匀,然后向各PCR反(fan)应(ying)管按20μl分装(zhuang);再分别加入 5μl抽(chou)提好(hao)的DNA模板或阴(yin)/阳(yang)性对照,盖好(hao)管盖;将(jiang)反(fan)应(ying)管置于 全自动荧光PCR检测(ce)仪(yi)中,参照仪(yi)器操作说明设(she)定阴(yin)/阳(yang)性对照、 待检样本(ben)参数(shu)进行PCR反(fan)应(ying),记录(lu)好(hao)样本(ben)摆放(fang)顺(shun)序。反(fan)应(ying)体系如下(xia)表(biao):


2、 Q-PCR仪的设置反(fan)应程序设定

第一(yi)步: 94 °C15分钟;第二(er)步:95 °C10 秒,55 °C 35 秒,45 个循(xun)环; 荧光素设(she)定为FAM在反(fan)应程(cheng)序(xu)的(de)第二(er)步55°C末(mo)读取荧光值。


 阴(yin)阳性判(pan)断:


超(chao)宽线性范(fan)围,扩增检(jian)测(ce)单(dan)拷贝,超(chao)高灵(ling)敏度